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在ELISA試劑盒中運用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。

多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡略，但抗血清成分凌亂，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位，ELISA試劑盒親和力和特異性均較多抗高，且制備技能老練，產量大，批間差異小，但結合位點的單一也正是其缺陷之地址，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體運用同一單抗，則由于結合位點的短少，簡略構成假陰．性成果。在運用雙單抗一步法時，應留意抗原過剩時的“鉤狀效應"。

在ELISA試劑盒中運用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即天然抗原、人工組成抗原和基因重組抗原。天然抗原的純度不高，特異性不強；組成抗原一般為多肽片段，短少天然抗原所具有的立體結構表位，親和力不高，可能導致相應表位的抗體漏檢；基因重組抗原具有安全、特異性強、親和力高、產量大等特征，是一種比較志向，但其純化比較困難。